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二氧化氯杀菌机理研究  

2013-06-25 23:59:23|  分类: 学术文摘 |  标签: |举报 |字号 订阅

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二氧化氯是一种安全高效的氧化型消毒剂,因其不与有机物发生取代反应而避免了产生三氯甲烷等致癌、致畸、致突变副产物,被视为传统氯消毒剂的换代产品。目前已被应用于饮用水和食品生产消毒、医疗器械消毒、藻类控制、室内污染的消除和公共卫生控制等。然而目前对二氧化氯作用机理的研究比较滞后。上世纪60 年代以来,国内外的一些研究者分别以核酸、蛋白质、细菌、病毒和酵母菌等为材料研究了二氧化氯的杀菌机制,但在个体水平上其杀菌的致命靶点是何物仍然存在很大争议。

二氧化氯杀菌机理研究 - CHINA-CLO2 - 中国消毒水网

 1 二氧化氯对重要生物分子的作用机制

在分子水平上阐明二氧化氯对生物大分子的作用机制是人们解释其杀菌机理的前提,也是科研人员一直以来的努力方向。作为一种非特异性的氧化型消毒剂,二氧化氯对微生物的致死靶点至今仍然存在很大争议。因此,扩大研究对象,阐明与细胞成分及生化过程相关的一些重要的生物大分子与二氧化氯的反应机制对于全面、深刻理解二氧化氯杀菌机理具有重要意义。目前已从化学、物理等角度研究氨基酸、谷胱甘肽、还原型辅酶Ⅰ( NADH) 、胞嘧啶、脱氧核苷三磷酸等重要分子在体外与二氧化氯作用的机制。

1. 1 二氧化氯与重要生物分子的作用途径

1. 1. 1 对二氧化氯敏感的氨基酸和蛋白质:

至今为止,人们发现二氧化氯只和几种还原性的氨基酸发生反应。有6种氨基酸表现出了与二氧化氯的反应活性( 以二氧化氯消耗量表示) ,分别是脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸和蛋氨酸。其中半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸的反应速度最快,其它3 种反应速度太慢而似乎与微生物失活无关。即便是前3 种敏感氨基酸,它们在天然和变性的病毒颗粒中与二氧化氯的反应活性差别很大。在f2 病毒颗粒中,色氨酸和半胱氨酸被包埋在蛋白质结构的内部而难于与二氧化氯反应,而酪氨酸因为有一部分暴露在蛋白表面可被二氧化氯氧化; 当病毒外壳蛋白被变性处理后,半胱氨酸和色氨酸被暴露,与二氧化氯的反应活性则显著提高。利用牛血清白蛋白( BSA) 和酿酒酵母的6-磷酸葡萄糖脱氢酶为模型的研究进一步证实了二氧化氯对酶活性的破坏。研究发现被二氧化氯氧化的蛋白质α-螺旋的数量减少并且整合有来自二氧化氯的氧原子( 而不是氯原子! ) ,确认了二氧化氯对色氨酸和酪氨酸的共价氧化,证明了二氧化氯与蛋白质不发生涉及氯原子的取代反应。

1.1. 2 二氧化氯对DNA 分子反应活性:

作为遗传信息的载体,DNA 在细胞物质的合成和遗传过程中具有重要作用。由于受到技术手段的限制,人们曾认为二氧化氯对DNA 的损伤不明显,但近年来的研究证明二氧化氯对DNA 有实质的损伤作用。

1.1. 3 二氧化氯与重要生物分子的反应途径:

二氧化氯与生物分子之间的反应途径有助于人们了解其杀菌的化学本质。一系列的研究表明,二氧化氯与酶和氨基酸的作用可能伴随有二氧化氯加合物( C( H) -OClO) 的生成。初始底物( 氨基酸) 一般先与第一个二氧化氯分子发生仅涉及单电子转移的氧化反应,形成的中间产物接着与第二个二氧化氯分子发生氧化反应,生成的二氧化氯加合物经过一系列后续反应最后生成终产物。

色氨酸与第一个二氧化氯分子的反应产生了色氨酰自由基阳离子,接着去质子化形成中性的色氨酰基,并马上与第二个二氧化氯分子反应,生成一个短暂存在的以C( H) -OClO 键连接的二氧化氯加合物,此加合物在一个涉及3 个电子的氧化反应中衰减生成次氯酸、N-甲酰犬尿氨( Nformylkynurenine,NFK) 和其它产物,在二氧化氯与半胱氨酸( CSH) 的反应中,可能的反应机制是一个电子从半胱氨酸转移到二氧化氯分子上,然后氧化型的半胱氨酸正离子基团( CS) 与第二个二氧化氯分子反应,形成半胱氨酸-ClO2加合物( CSOClO) 。酪氨酸与二氧化氯反应产生的酚氧自由基快速地结合下一个二氧化氯分子,形成带有C( H) OClO 键的短暂存在的加合物,然后迅速衰减生成多巴醌。NADH 则首先转移一个电子到二氧化氯分子,然后传递一个H 给H2O,最后又转移一个电子给第二个二氧化氯分子,形成的产物包括两个ClO2-,一个H3O+和一个NAD+。上述研究报道显示形成二氧化氯加合物是二氧化氯氧化反应的一个共性特征。

1. 2 环境pH 值对二氧化氯与生物大分子作用的影响

环境pH 值对二氧化氯的杀菌效果有明显影响。在pH6-9 的范围内,环境pH 值越高,杀菌效果越好,二氧化氯在环境pH8. 0 时对隐孢子虫卵的杀灭效率是pH6. 0 溶液时的2 倍。这种杀菌效果的差异与不同酸碱度下二氧化氯的反应途径和速度不同有关。环境pH 值影响着二氧化氯与色氨酸的反应级数: 在环境pH < 5 时二氧化氯的反应为二级反应; 环境pH > 5. 0 时,则呈一级反应。在低环境pH 值的条件下,二氧化氯与半胱氨酸的反应摩尔比是6∶ 5,而在高环境pH 值的条件下,反应摩尔比是2: 10,因此在环境高pH 值下氧化半胱氨酸的效率更高。在环境pH6. 7 时,二氧化氯与半胱氨酸的反应速度比与胱氨酸的快7 个数量级。在环境pH4 - 7 的范围内,二氧化氯对酪氨酸的氧化反应速度随着环境pH 值的增高而显著增大,并产生一系列的氧化产物。了解环境pH 值对二氧化氯氧化作用的影响可纠正国内部分人认为二氧化氯杀菌效果不受环境pH 值影响的观点,有利于在实践过程中遵循规律,最大限度发挥其杀菌效用。

2 二氧化氯对微生物个体水平的杀灭机理

二氧化氯对一些重要生物分子的作用机制为人们深入理解二氧化氯的杀菌机理奠定了理论基础。但是对于二氧化氯这种非特异性氧化型消毒剂而言,如何以离体的分子损伤事件解释具体的生理功能损伤,特别是找到细菌致死的首要靶标,并不是一件容易的事情。目前,以细菌、病毒和真菌为对象的二氧化氯杀菌机理研究均有报道,但其杀菌的致命靶点是何物仍然存在很大争议。

2. 1 二氧化氯对细菌作用机理研究进展

2. 1. 1 二氧化氯对细菌细胞屏障及其生理功能的损伤:

传统的氯消毒剂( Cl2、NaClO 等) 对细菌的形态和结构均有比较明显的损伤,与此不同的是二氧化氯对细胞形态结构的破坏不明显,因此破坏细胞形态结构可能不是二氧化氯杀灭细胞的主要方式。即使形态结构保持完整,但是二氧化氯的作用会造成膜的通透性增加,细胞内钾离子、镁离子和ATP 等小分子物质大量泄漏。值得注意的是,即使很高的二氧化氯浓度也不会造成细菌DNA 和蛋白质等大分子物质的大量漏出。蛋白质的泄漏则不仅总量偏少,而且随着二氧化氯浓度的增高呈下降趋势,推测可能是高浓度的二氧化氯使细胞膜上的通道收缩堵塞所致。虽然研究都发现了胞内小分子物质泄漏现象,但因为二氧化氯作用时还伴随有酶失活等其它的损伤事件,所以认定小分子物质泄漏为细菌致死原因难以令人信服。

由于细菌没有细胞器,很多酶系分布在细胞膜上,膜的损伤不但表现为通透性增加,还伴随有酶的失活和生理功能的丧失。对大肠杆菌的研究显示,二氧化氯造成大量的钾离子泄漏的同时,细胞呼吸被明显抑制,但在亚致死浓度下就出现了呼吸抑制现象,因此认为呼吸抑制对于细菌致死不如钾离子泄漏那么重要。国内有研究发现二氧化氯作用后的白色念珠菌细胞的内外结构保持完整,但是胞内的钾离子和ATP 大量泄漏,细胞质膜电位消失并与死亡率有很高的对应性,表明虽然细胞膜没有明显的物理损伤,但是生理功能遭到严重破坏。以原核生物为材料研究细胞膜损伤与杀菌的关系存在的一个缺陷是膜损伤和膜系酶损伤交织在一起而无法区分,如果以真核生物为材料则可有效避免此类问题。选用真核微生物白色念珠菌作为材料的研究表明呼吸抑制确实与死亡不同步,呼吸抑制率在不同的时间点始终低于菌体死亡率,并且杀菌处理后在厌氧和好氧培养条件下的死亡率没有显著差异,有力支持了关于呼吸抑制不是二氧化氯杀菌首要靶点的观点。

二氧化氯对细菌生理的损伤还包括蛋白质合成抑制和酶失活。国外学者分别用14C 标记的苯丙氨酸和缬氨酸掺入法,观察到了明显的蛋白质合成受阻现象,他推测是二氧化氯破坏了核糖体的结构,使之

失去合成蛋白质的功能而致细菌死亡。但以流感嗜血杆菌( Haemophilus influenzae) 作为材料的研究结果则显示总脱氢酶的活力被完全抑制时仍有部分细菌存活,最小致死浓度下蛋白质合成也只是部分被抑制,因此推测二氧化氯对细菌的致命靶点不是脱氢酶、也不是蛋白质合成,而是在其它方面。

2. 1. 2 二氧化氯对DNA 的损伤:

Young 等研究了枯草芽胞杆菌芽胞被二氧化氯作用的机理。野生型芽胞内具有α 型及β 型小分子酸性可溶DNA 保护蛋白,研究表明这2 种保护蛋白的的缺失突变体( α - β - ) 对二氧化氯的敏感性与野生型比较没有明显差异,Young 推测可能是芽胞内膜遭二氧化氯破坏而致细胞死亡。酿酒酵母D7 双倍体菌株的试验发现仅在二氧化氯为5 - 10 倍于实际水处理浓度时才表现出对酵母的基因毒性。韦明肯等的研究表明,只有很高浓度的二氧化氯才对离体质粒的PCR 反应模板活性和转化大肠杆菌的效率产生显著影响,这或许也说明了对DNA 的损伤可能不是杀灭细菌的主要靶标。

总之,目前在二氧化氯对细菌的致死靶点上难以得出排他性的结论,但相比之下,DNA 对细菌致死的相关性比蛋白失活和膜通透性及膜电位的损伤要低。

2. 2 二氧化氯对病毒作用机理研究进展

研究者对于核酸和衣壳何者是二氧化氯失活病毒的靶点一直存在争议。二氧化氯与氯气的显著不同在于,氯气会使脊髓灰质炎病毒的超显微结构发生变化,而二氧化氯则在没有造成形态损伤的情况下将该病毒杀灭。有人证明了二氧化氯对病毒RNA 有降解和抑制合成的作用。Alvarez 等发现被碘和二氧化氯氧化的病毒外壳蛋白的等电点均从7. 0 下降到5. 8,所不同的是被二氧化氯灭活的脊髓灰质炎病毒仍然能够正常吸附、穿透寄主细胞并起始脱壳作用,而碘灭活的病毒则失去了对宿主的吸附能力; 另一方面,[14C]尿嘧啶示踪的RNA 合成量明显下降,因此推测二氧化氯是通过破坏病毒RNA使其丧失模板功能,阻断了新RNA 合成而使病毒失活。Li 等用ELISA、长距离步移RT-PCR 法研究了二氧化氯杀灭甲肝病毒的机理,发现失活病毒基因组的5 `端非编码区缺失了一个600 碱基的RNA片段。由于二氧化氯作用后甲肝病毒的灭活与其RNA 的5 ‵端非编码区的破坏相一致,李君文等认为可以用PCR 法来检测甲肝病毒的灭活效果。Simonet 也发现了二氧化氯对降解脊髓灰质炎病毒5'-UTR and 3'-UTR 末端的非翻译区具有偏好性。奇怪的是,二氧化氯对病毒DNA 的损伤作用目前未见报道。

也有一些研究者认为蛋白质衣壳是二氧化氯的失活靶点。Noss 也认为酪氨酸被氧化是噬菌体f2失活的主要原因,因为在二氧化氯作用下,酪氨酸残基的下降曲线和病毒活力的下降曲线趋势一致,虽然前者的速度要比后者慢得多。Hauchman 等发现f2 噬菌体被二氧化氯灭活以后失去了对宿主的侵染力,但核酸仍然具有活性,由此推测病毒失活可能是因为蛋白质衣壳被破坏引起。

3 总结

目前对二氧化氯在氨基酸水平上的氧化机制有了比较明确的认识,但是在生理结构和功能水平上仍然存在着很大的争议。由于氨基酸等分子普遍分布于各种细胞组分中,仅研究离体分子的损伤显然无法了解不同细胞组分受损的轻重,也无法判断它们与杀菌作用的关联度。只有把分子损伤落实到具体的结构与功能上,并与微生物的杀灭率相联系,才能比较全面地阐述二氧化氯的杀菌机理,这也是目前研究的的难点所在。

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